In Vitro Skin Sensitisation - Keratinocyte Activation
针对角质形成细胞激活关键事件的体外皮肤致敏试验 - OECD测试指南第442D号
皮肤致敏, 体外试验, 角质形成细胞, AOP, ARE-Nrf2, Luciferase
1. 文档说明
原文信息：
| 项目 | 内容 |
|---|---|
| 文档标题 | In Vitro Skin Sensitisation Assays addressing the Adverse Outcome Pathway Key Event on Keratinocyte activation |
| 文档编号 | OECD/OCDE 442D |
| 发布日期 | 2022年6月30日 |
| 更新日期 | 2024年6月25日 |
| 文档类型 | OECD化学品测试指南 |
| 所属章节 | 第4节 健康效应 |
翻译说明：
- 本文档为OECD测试指南第442D号的中文翻译版本
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2. 主要内容
本测试指南描述了针对皮肤致敏不良结局路径（AOP）第二个关键事件——角质形成细胞激活的体外试验方法。
2.1 包含的试验方法：
- ARE-Nrf2荧光素酶KeratinoSens™试验方法
- ARE-Nrf2荧光素酶LuSens试验方法
- 表皮致敏试验–EpiSensA
2.2 关键概念：
- 不良结局路径（AOP）：从分子起始事件到不良效应的生物学路径框架
- 角质形成细胞激活：皮肤致敏AOP的第二个关键事件
- ARE-Nrf2通路：抗氧化反应元件依赖的信号通路
- 体外试验：不使用活体动物的替代试验方法
3. 总体介绍
基于角质形成细胞激活关键事件的测试指南
- 皮肤致敏剂是指根据联合国全球化学品分类和标签协调制度（UN GHS）的定义，经反复皮肤接触后会导致过敏反应的物质。
对于皮肤致敏背后的关键生物学事件，人们已达成了普遍共识。目前关于与皮肤致敏相关的化学和生物学机制的知识已被总结为不良结局路径（AOP），从分子起始事件开始，经过中间事件，最终导致不良效应，即过敏性接触性皮炎。
该AOP重点关注与硫醇（即半胱氨酸）和伯胺（即赖氨酸）反应的化学品，以及可被代谢激活为蛋白质反应性物质的化学品。蛋白质反应性导致半抗原-蛋白质复合物（即半抗原化）的形成，这是该AOP的分子起始事件（MIE）。
下游关键事件包括：
- 角质形成细胞激活
- 树突状细胞激活
- T细胞增殖
皮肤致敏AOP及其关键事件在OECD指导文件第297号中有详细描述。
- 皮肤致敏AOP为开发针对各个关键事件的化学层面和体外试验方法提供了框架。
OECD已采用的方法：
- 2012年： DPRA（直接肽反应性试验）- OECD TG 442C - 针对分子起始事件
- 2015年： 树突状细胞激活试验 - OECD TG 442E
- 2017年： 角质形成细胞激活试验 - OECD TG 442D（本指南）
这些方法具有科学有效性，当作为测试与评估整合策略（IATA）的一部分使用时，被接受用于皮肤致敏剂的危害识别。
3.1 历史背景
- 皮肤致敏的评估历来涉及实验动物的使用：
豚鼠试验： - 豚鼠最大化试验（GPMT）- Magnusson和Kligman - Buehler试验 - OECD TG 406 - 评估诱导期和激发期
小鼠试验： - 局部淋巴结试验（LLNA）- OECD TG 429 - LLNA:DA - OECD TG 442A - LLNA:BrdU-ELISA - OECD TG 442B - LLNA:BrdU-FCM - OECD TG 442B - 仅评估诱导期 - 在动物福利方面优于豚鼠试验
3.2 体外方法的发展
- 基于机制的化学层面和体外试验方法针对皮肤致敏AOP的前三个关键事件已被OECD采纳为测试指南：
| 关键事件 | 方法类型 | OECD测试指南 |
|---|---|---|
| 分子起始事件（蛋白质结合） | 化学层面 | TG 442C (DPRA) |
| 树突状细胞激活 | 体外（细胞） | TG 442E |
| 角质形成细胞激活 | 体外（细胞） | TG 442D（本指南） |
DPRA（TG 442C）：无细胞试验，定量测定肽消耗
树突状细胞试验（TG 442E）：使用人源细胞系（U937、THP-1、MUTZ-8）或原代细胞（外周血单个核细胞）
角质形成细胞试验（TG 442D）：使用人源细胞系或重组人体表皮模型
4.三个试验方法简介
4.1 KeratinoSens™试验方法
- 原理： ARE-Nrf2荧光素酶报告基因试验
- 基因：人源AKR1C2基因 AKR1C2（醛酮还原酶家族1成员C2）
- 细胞系： 转染了稳定整合荧光素酶报告基因质粒的永生化人角质形成细胞系（HaCaT）
- 检测终点： 荧光素酶活性
- 验证状态： 验证参考方法（VRM）
- 验证机构： EURL ECVAM
4.2 LuSens试验方法
- 原理： ARE-Nrf2荧光素酶报告基因试验（与KeratinoSens类似）
- 基因：大鼠NQO1基因 NQO1（NAD(P)H醌氧化还原酶1）
- 细胞系： 转染了ARE报告基因的HaCaT细胞系
- 检测终点： 荧光素酶活性
- 验证状态： 基于性能标准验证
- 验证机构： EURL ESAC
4.3 EpiSensA试验方法
- 原理： 基因表达定量检测
- 细胞模型： 重组人体表皮（RhE）模型
- 检测终点： 标志基因表达（ATF3、IL-8、GCLM、DNAJB4）
- 检测技术： 逆转录-定量PCR（RT-qPCR）
- 验证状态： 验证参考方法（VRM）
- 验证机构： JaCVAM
专业术语表
| 英文 | 中文 | 解释 |
|---|---|---|
| AOP | 不良结局路径 | 从分子起始事件到不良效应的生物学路径 |
| MIE | 分子起始事件 | AOP的第一个分子事件 |
| Key Event | 关键事件 | AOP中的可测量事件 |
| Keratinocyte | 角质形成细胞 | 表皮的主要细胞类型 |
| Dendritic Cell | 树突状细胞 | 抗原呈递细胞 |
| Skin Sensitiser | 皮肤致敏剂 | 可导致皮肤过敏反应的物质 |
| In Vitro | 体外 | 在生物体外进行的试验 |
| In Chemico | 化学层面 | 在非生物系统中进行的化学试验 |
| Haptenation | 半抗原化 | 半抗原与蛋白质结合的过程 |
| ARE | 抗氧化反应元件 | 调节抗氧化基因表达的DNA序列 |
| Nrf2 | 核因子E2相关因子2 | 调节抗氧化反应的转录因子 |
| Luciferas | 荧光素酶 | 发光酶，作为报告基因 |
| IATA | 测试与评估整合策略 | 整合多种数据和信息的方法 |
| VRM | 验证参考方法 | 通过验证的参考方法 |
| RhE | 重组人体表皮 | 体外培养的人体表皮模型 |
参考文献
本指南引用的主要参考文献包括：
- OECD (2019). Guidance Document on the AOP for Skin Sensitisation. Series on Testing and Assessment No. 297.
- OECD (2021). Test Guideline 442C: In Chemico Skin Sensitisation. Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA).
- OECD (2021). Test Guideline 442E: In Vitro Skin Sensitisation.