OECD测试指南第442C号：体外化学法皮肤致敏性测试
体外化学法皮肤致敏性测试–多肽结合测算法
OECD, 测试指南, 毒理学, 体外测试, 皮肤致敏，442C
文档信息
| 属性 | 内容 |
|---|---|
| 指南编号 | 442C号 |
| 发布日期 | 2025年6月25日 |
| 文档类型 | OECD测试指南 |
| 主题 | 体外化学法皮肤致敏性测试——针对蛋白质共价结合关键事件的不良结局路径测定方法 |
| 章节 | 第4节 - 健康效应 |
1. 背景
1.1 基于蛋白质共价结合关键事件的测试指南
皮肤致敏物是指根据联合国全球化学品统一分类和标签制度(UN GHS)的定义，在反复皮肤接触后会导致过敏反应的物质。对于皮肤致敏性背后的关键生物学事件，目前已达成共识。与皮肤致敏性相关的化学和生物学机制的现有知识已被总结为不良结局路径(AOP)，从分子起始事件经过中间事件直至不良效应，即过敏性接触性皮炎。
过敏AOP关注与氨基酸残基（即半胱氨酸或赖氨酸）发生反应的化学物质，如有机化学物质。在此情况下，分子起始事件（即第一个关键事件）是亲电性物质与皮肤蛋白质中亲核中心的共价结合。AOP中的第二个关键事件发生在角质形成细胞中，包括炎症反应以及与特定细胞信号通路（如抗氧化/亲电反应元件（ARE）依赖性通路）相关的基因表达变化。第三个关键事件是树突状细胞的活化，通常通过特定细胞表面标志物、趋化因子和细胞因子的表达来评估。第四个关键事件是T细胞增殖。
皮肤致敏性的评估通常涉及实验动物的使用。使用豚鼠的经典方法，即Magnusson和Kligman豚鼠最大化试验(GPMT)和Buehler试验(OECD TG 406), 评估皮肤致敏性的诱导期和激发期。小鼠试验，如LLNA(OECD TG 429)及其三种非放射性改良方法——LLNA:DA(OECD TG 442A)、LLNA:BrdU-ELISA和BrdU-FCM(OECD TG 442B)——均仅评估诱导反应，并已获得认可，因为它们在动物福利方面优于豚鼠试验，同时可对皮肤致敏性的诱导期进行客观测量。
1.2 基于关键事件的测试指南所包含测试方法的背景和原理
本测试指南（TG）描述了针对皮肤致敏性AOP第一个关键事件所述机制的体外化学测定方法，即蛋白质共价结合。本测试指南目前包含的测试方法有
- 直接肽反应性测定(DPRA)
- 氨基酸衍生物反应性测定(ADRA)
- 动力学直接肽反应性测定(kDPRA)
这些测试方法基于蛋白质的体外化学共价结合，被认为具有科学有效性。DPRA已在欧盟替代动物测试参考实验室（EURL ECVAM）主导的验证研究及随后的EURL ECVAM科学咨询委员会（ESAC）独立同行评审中进行评估, ADRA在日本替代方法验证中心（JaCVAM）协调的验证研究中进行了验证,随后进行了独立同行评审。kDPRA经过行业协调的验证研究及随后的独立同行评审。
蛋白质反应性与皮肤致敏潜力之间的相关性已得到充分证实，然而由于蛋白质反应性仅代表皮肤致敏性AOP的一个关键事件，使用针对该特定关键事件开发的测试方法所产生的信息可能不足以作为独立方法来断定化学物质是否存在或缺乏皮肤致敏潜力。因此，建议将本测试指南所述测试方法产生的数据用于综合测试评估方法（IATA）框架内，与其他针对皮肤致敏性AOP其他关键事件的体外测定相关补充信息以及非测试方法（包括计算机模拟建模和化学类似物的交叉参照）一起使用。在定义方法（DA）中使用这些方法产生的数据示例——即标准化使用的信息源集合和应用推导预测程序的方法——已发表，并在OECD TG 497关于皮肤致敏性定义方法中实施。如果打算在皮肤致敏性定义方法中使用这些方法的数据，请参阅测试指南497以了解边界标准或其他数据解释程序的应用.
DPRA和ADRA分别支持皮肤致敏物（1类）与非致敏物的区分。根据监管框架，这些方法产生的阳性结果可单独用于将化学物质归类为UN GHS 1类。然而，这些测试方法本身不能将皮肤致敏物细分为1A和1B子类别，这是UN GHS（1）为实施这两个可选子类别的当局所定义的，也不能用于安全评估决策的效力预测
kDPRA可以区分UN GHS 1A子类别皮肤致敏物与未被归类为1A子类别（非1A子类别）即1B子类别或无类别的致敏物,但不能区分致敏物（1类）与非致敏物。根据监管框架，kDPRA产生的阳性结果可单独用于将化学物质归类为UN GHS 1A子类别
2. 相关词汇
- 准确性（Accuracy）：测试方法结果与公认参考值之间的一致程度。它是测试方法性能的衡量指标，也是相关性的一个方面。该术语常与一致性互换使用，指测试方法正确结果的比例。用于推导准确性的公式见”预测能力的计算”
- ADRA：氨基酸衍生物反应性测定
- AOP（不良结局路径）：从目标化学物质或一组相似化学物质的化学结构开始，经过分子起始事件直至感兴趣的体内结局的事件序列
- 平衡准确性（Balanced accuracy）：敏感性和特异性的平均值。当测试的体内阳性和体内阴性化学物质数量不同时，该指标特别有用。它是评估测试方法相关性的重要考虑因素。用于推导平衡准确性的公式见”预测能力的计算”
预测能力的计算
敏感性、特异性、准确性和平衡准确性基于真阳性（TP）、真阴性（TN）、假阴性（FN）和假阳性（FP）值计算如下：
敏感性
\[
\text{敏感性} = \frac{\text{真阳性数(TP)}}{\text{所有阳性化学物质数(TP+FN)}} \times 100
\]
特异性
\[
\text{特异性} = \frac{\text{真阴性数(TN)}}{\text{所有阴性化学物质数(TN+FP)}} \times 100
\]
准确性
\[
\text{准确性} = \frac{\text{正确预测数(TP+TN)}}{\text{所有化学物质数(TP+FN+TN+FP)}} \times 100
\]
混淆矩阵的理解
| 实际情况：阳性 (Positive) | 实际情况：阴性 (Negative) | |
|---|---|---|
| 检测结果：阳性 (+) | 真阳性 (TP) ✅ 抓对了 |
假阳性 (FP) ❌ 误伤好人 |
| 检测结果：阴性 (-) | 假阴性 (FN) ❌ 漏网之鱼 |
真阴性 (TN) ✅ 放对了 |
如何理解?
敏感性(Sensitivity): 真阳性，召回率(Recall)，有多少阳性被找出来了，如果敏感度很高说明测试非常敏锐，几乎不会放过一个真正的阳性，适用于”宁可错杀，不放过”的场景
特异性(Specificity): 真阴性，1-假阳性率，有多少阴性被找出来了，如果特异性很高说明测试非常准确，几乎不会误伤一个真正的阴性，适用于”宁放过，不误杀”的场景
\[ \text{平衡准确性} = \frac{\text{敏感性} + \text{特异性}}{2} \]
校准曲线（Calibration curve）：实验响应值与已知物质的分析浓度（也称标准曲线）之间的关系
变异系数（Coefficient of variation）：通过将标准差除以平均值计算的一组重复数据的变异性衡量指标。可以乘以100以百分比表示
定义方法（Defined Approach, DA）：DA由应用于使用定义信息源集合产生的数据（如计算机模拟预测、体外化学法、体外数据）的固定数据解释程序（如统计、数学模型）组成，以推导预测
DPRA：直接肽反应性测定
EDTA：乙二胺四乙酸
EURL ECVAM：欧盟替代动物测试参考实验室
IATA（综合测试评估方法）：用于化学物质或一组化学物质危害识别（潜力）、危害表征（效力）和/或安全评估（潜力/效力和暴露）的结构化方法，策略性地整合和权衡所有相关数据，以告知有关潜在危害、风险以及需要进一步针对性因此最小化测试的监管决策
JaCVAM：日本替代方法验证中心
kDPRA：动力学直接肽反应性测定
kmax：在kDPRA中根据反应动力学确定的受试物质的最大速率常数（单位：s⁻¹M⁻¹）
LLNA：2010年发布的OECD TG 429小鼠局部淋巴结试验
分子起始事件（Molecular Initiating Event）：在不良结局路径中被确定为起始事件的化学物质在分子水平上对生物系统的扰动
混合物（Mixture）：由两种或多种不发生化学反应的物质组成的固体或液体
单组分物质（Mono-constituent substance）：由其定量组成定义的物质，其中一种主要组分占整体的至少80%（w/w）
多组分物质（Multi-constituent substance）：由其定量组成定义的物质，其中两种或多种主要组分以≥10%（w/w）且<80%（w/w）的浓度存在。多组分物质是制造过程的结果。混合物与多组分物质的区别在于，混合物由两种或多种不发生化学反应的物质组成，而多组分物质由两种或多种发生化学反应的物质组成
NAC：N-(2-(1-萘基)乙酰基)-L-半胱氨酸
NAL：α-N-(2-(1-萘基)乙酰基)-L-赖氨酸
预半抗原（Pre-haptens）：通过非生物转化成为致敏物的化学物质
前半抗原（Pro-haptens）：需要酶活化才能发挥皮肤致敏潜力的化学物质
TFA：三氟乙酸
3. 三种方法比较
直接肽反应性测定（DPRA），氨基酸衍生物反应性测定（ADRA），动力学直接肽反应性测定（kDPRA）三种方法比较
3.1 直接肽反应性测定（DPRA）
DPRA通过定量测定受试化学物与含半胱氨酸或赖氨酸的模型合成肽的反应性来评估皮肤致敏潜力
- 合成肽序列：半胱氨酸肽
Ac-RFAACAA-COOH，赖氨酸肽Ac-RFAAKAA-COOH - 肽中含有苯丙氨酸以辅助UV检测
- 受试化学物与肽孵育24小时后，通过HPLC测量剩余肽浓度
- 计算肽耗竭百分比，用于分类判断
模拟空间位阻：在真实的蛋白质中，氨基酸是被包裹在肽链中间的，周围有其他氨基酸。游离氨基酸太“自由”了，反应太快，无法真实反映化学物质在接触皮肤蛋白时的反应速率
基于验证研究数据（与LLNA比较）：
| 指标 | 数值 |
|---|---|
| 准确性 | 80% (N=157) |
| 敏感性 | 80% (88/109) |
| 特异性 | 77% (37/48) |
| 实验室内重现性 | ~85% |
| 实验室间重现性 | ~80% |
适用范围
- 多种有机官能团、反应机制、皮肤致敏效力的化学物质
- 可测试多组分物质和已知组成的混合物
主要局限
| 物质类别 | 局限性说明 |
|---|---|
| 金属化合物 | 通过非共价机制反应，不应测试 |
| 前半抗原 | 需酶活化，可能假阴性 |
| 共洗脱物质 | 220 nm吸收并与肽保留时间相同 |
| 不溶物质 | 阴性结果不确定 |
| DMSO溶剂 | 导致半胱氨酸二聚化 |
3.2 氨基酸衍生物反应性测定（ADRA）
ADRA使用带有萘环标签的氨基酸衍生物作为亲核试剂，增强了检测灵敏度：
- NAC：N-(2-(1-萘基)乙酰基)-L-半胱氨酸（半胱氨酸衍生物）
- NAL：α-N-(2-(1-萘基)乙酰基)-L-赖氨酸（赖氨酸衍生物）
萘环的引入使得：
- UV检测波长移至281 nm（减少干扰）
- 可使用荧光检测（Ex/Em 284/333 nm）
- 试剂浓度大幅降低（从DPRA的0.667 mM降至5 μM）
荧光检测的优势：由于受试化学物很少在特定激发/发射波长处具有荧光，使用FL检测器可显著减少因UV吸收组分共洗脱导致的不确定结果。
性能表现
基于验证研究数据：
| 指标 | vs LLNA | vs 人体数据 |
|---|---|---|
| 准确性 | 76% | 84% |
| 敏感性 | 76% | 83% |
| 特异性 | 79% | 86% |
| 平衡准确性 | 77% | 84% |
| 实验室内重现性 | 100% | — |
| 实验室间重现性 | 100% | — |
适用范围：
- 多种有机官能团、反应机制、皮肤致敏效力的化学物质
- 难溶化学物（仅需4 mM或0.5 mg/mL）
- 混合物和UVCB物质（可使用重量法）
主要局限
| 物质类别 | 局限性说明 |
|---|---|
| 金属化合物 | 通过非共价机制反应，不应测试 |
| 前半抗原 | 需酶活化，可能假阴性 |
| UV/荧光共洗脱 | 两种检测器都共洗脱时报告”不确定” |
| DMSO溶剂 | 允许≤5%，可能导致NAC二聚化 |
3.3动力学直接肽反应性测定（kDPRA）
kDPRA是DPRA的改良版本，通过测量多种浓度和时间点的反应动力学，计算最大速率常数来评估致敏效力。
核心概念：
- 反应速率常数决定表位形成量
- 速率常数是效力的关键决定因素
- 可区分强致敏物（1A子类别）与较弱致敏物
检测原理：
使用单溴联苯胺与未耗竭的半胱氨酸肽反应形成荧光复合物：
\[ \text{荧光复合物} = \text{半胱氨酸肽（未结合）} + \text{mBrB} \]
检测波长：激发390 nm / 发射480 nm
预测模型
| 反应速率 | kDPRA预测 |
|---|---|
| log kmax ≥ -2.0 | UN GHS 1A子类别 |
| 非反应性或 log kmax < -2.0 | 非1A子类别（1B或无类别） |
主要局限
| 物质类别 | 局限性说明 |
|---|---|
| 金属化合物 | 通过非共价机制反应，不应测试 |
| 仅赖氨酸反应性物质 | 需配合DPRA/ADRA确认 |
| 硫醇类物质 | 与mBrB探针反应，无法测试 |
| 氢醌/儿茶酚/芳香胺 | 氧化滞后可能降低表观速率 |
| 前半抗原 | 可能被低估 |
| 荧光干扰物质 | 自荧光或猝灭导致假耗竭 |
| UVCB物质 | 需定义摩尔比，模型无法使用 |
唯一可区分1A子类别的体外化学方法
3.4 应用场景
| 应用场景 | 推荐方法 | 说明 |
|---|---|---|
| 初步危害识别 | DPRA 或 ADRA | 区分致敏物与非致敏物 |
| 强致敏物确认 | kDPRA | 阳性结果可直接归类为1A |
| 效力评估 | kDPRA | 提供连续log kmax值 |
| 难溶化学物 | ADRA | 低浓度要求，重量法适用 |
| 混合物测试 | ADRA | 重量法（0.5 mg/mL） |
| UV吸收物质 | ADRA（荧光检测） | 减少共洗脱干扰 |
参考文献
本指南引用的主要参考文献包括：
- OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Series on Testing and Assessment, No. 34. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris, France.
- OECD (2012), The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Series on Testing and Assessment No. 168, OECD, Paris.
- United Nations (UN) (2021), Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2021.