ARE-Nrf2荧光素酶KeratinoSens™体外皮肤致敏试验标准操作程序

OECD 测试指南 442D 附录IA

Author

基于OECD TG 442D (2024)

Published

June 25, 2024

概述

1. 目的

本标准操作程序（SOP）描述了ARE-Nrf2荧光素酶KeratinoSens™体外皮肤致敏试验方法，用于：

  • 识别皮肤致敏化学品(UN GHS(1)),过敏和不过敏
  • 评估化学品激活角质形成细胞的潜力
  • 支持皮肤致敏危害识别
  • 作为测试与评估整合策略（IATA）的组成部分

2. 原理

KeratinoSens™试验基于皮肤致敏不良结局路径（AOP）的第二个关键事件：

  • 角质形成细胞激活通过Nrf2-ARE通路评估
  • 荧光素酶报告基因在人AKR1C2基因抗氧化反应元件（ARE）控制下稳定转染
  • 致敏剂机制：亲电性物质与Keap1蛋白的半胱氨酸残基共价结合，导致Nrf2释放
  • Nrf2激活：释放的Nrf2转位至细胞核，结合ARE元件，启动下游基因转录
  • 检测终点：荧光素酶活性作为Nrf2激活的定量指标

3. 适用范围

3.1 适用化学品类型

适用于以下化学品的测试：

  • 化妆品成分
  • 工业化学品
  • 农药活性成分
  • 药物成分

3.2 局限性

本方法不适用于或需要谨慎解释的情况：

  • 仅与赖氨酸残基反应的物质（可能假阴性）
  • 前半抗原（pro-haptens）和预半抗原（pre-haptens）
  • 干扰荧光素酶活性的物质
  • 在测试浓度下不溶解或不形成稳定分散的物质

材料与试剂

1. 细胞系

KeratinoSens™转基因细胞系

参数 规格
细胞类型 永生化人角质形成细胞（HaCaT）
转染基因 在人AKR1C2基因ARE控制下的荧光素酶报告基因
获取方式 需签署标准协议（含商业使用许可）

细胞质量控制：

  • 支原体检测阴性
  • 细胞形态正常
  • 最大传代数：25代
  • 定期进行荧光素酶诱导测试

细胞库管理：

  • 建立主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB）
  • 使用液氮冷冻保存
  • 记录传代历史

2. 培养基与试剂

2.1 维持/生长培养基

组分 浓度
DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基） 基础培养基
胎牛血清（FBS） 10% (v/v)
Geneticin（G418硫酸盐） 200-600 µg/mL
青霉素 100 IU/mL
链霉素 100 µg/mL

培养条件：

  • 温度：37°C
  • CO₂：5%
  • 湿度：≥95%

2.2 测试培养基

组分 浓度
DMEM 基础培养基
胎牛血清（FBS） 10% (v/v)

注意：测试培养基中不含Geneticin和抗生素

2.3 荧光素酶检测试剂

试剂 规格
荧光素酶底物 Promega产品（需遵守使用许可）
细胞裂解缓冲液 根据制造商推荐
PBS（磷酸盐缓冲液） pH 7.4

2.4 细胞毒性检测试剂（MTT法）

试剂 浓度
MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物） 5 mg/mL
SDS（十二烷基硫酸钠） 10% (w/v)
异丙醇 ｜ 室温20min ｜

MTT配制：

  • CAS号：298-93-1
  • 溶解于PBS或培养基(5mg/mL 母液)
  • 过滤除菌

SDS裂解液/异丙醇：

  • 用于溶解formazan晶体
  • 孵育时间：过夜或直至完全溶解
  • 异丙醇室温20min震荡

2.5 溶剂与载体

溶剂 CAS号 纯度要求 最终浓度
DMSO（二甲基亚砜） 67-68-5 ≥99% 1% (v/v)
无菌水 - - 按需
培养基 - - 按需

3. 对照物质

3.1 阳性对照

肉桂醛（Cinnamic Aldehyde）：

参数 规格
CAS号 14371-10-9
纯度 ≥98%
储备液浓度 6.4 mM（溶于DMSO）
测试浓度范围 4-64 µM（5个浓度）
稀释因子 2倍系列稀释

预期结果：

  • EC₁.₅值：7-30 µM
  • 在64 µM时诱导倍数：2-8

3.2 阴性对照

对照类型 物质 浓度
溶剂对照 DMSO 1% (v/v)
空白对照 裂解缓冲液（无细胞） -

3.3 熟练度测试物质

实验室在常规使用前必须使用以下10种熟练度物质证明技术能力：

序号 物质名称 CAS号 预期结果 EC₁.₅参考范围（µM） IC₅₀参考范围（µM）
1 水杨酸 69-72-7 阴性 >1000 >1000
2 乳酸 50-21-5 阴性 >1000 >1000
3 甘油 56-81-5 阴性 >1000 >1000
4 异丙醇 67-63-0 阴性 >1000 >1000
5 乙二醇二甲基丙烯酸酯 97-90-5 阳性（弱） 5-125 >500
6 肉桂醇 104-54-1 阳性（弱） 25-175 >1000
7 2-巯基苯并噻唑 149-30-4 阳性（中） 25-250 >500
8 4-甲基氨基苯酚硫酸盐 55-55-0 阳性（强） <12.5 20-200
9 甲基二溴戊二腈 35691-65-7 阳性（强） <20 20-100
10 2,4-二硝基氯苯 97-00-7 阳性（极强） <12.5 5-20

要求：

  • 至少8/10物质的预测结果正确
  • EC₁.₅和IC₅₀值在参考范围内

4. 受试化学品制备

4.1 储备液配制

可溶性物质：

  1. 称量适量受试化学品
  2. 溶解于DMSO至200 mM
  3. 若不溶于DMSO，使用无菌水或培养基
  4. 过滤除菌（0.22 µm滤膜）

无明确分子量物质：

  • 制备40 mg/mL或4% (w/v)储备液

4.2 系列稀释

12个浓度制备（DMSO中）：

浓度编号 浓度（mM）
1 200
2 100
3 50
4 25
5 12.5
6 6.25
7 3.13
8 1.56
9 0.78
10 0.39
11 0.20
12 0.098

稀释步骤：

  1. 在DMSO中制备12个主浓度
  2. 在含血清培养基中25倍稀释
  3. 在测试板中再次4倍稀释
  4. 最终浓度范围：0.98-2000 µM

无分子量物质：

  • 最终浓度范围：0.98-4000 µg/mL

仪器设备

1. 细胞培养设备

设备 规格
CO₂培养箱 37°C，5% CO₂，湿度≥95%
生物安全柜 II级A2型
倒置显微镜 相差功能
96孔板组织培养处理板 无菌、透明底、白色底（发光检测用）
血球计数板 细胞计数
离心机 细胞沉淀用
液氮罐 细胞储存

2. 检测设备

设备 规格
发光检测仪（Luminometer） 高灵敏度、注射器系统
酶标仪/分光光度计 570 nm检测波长（MTT用）
微孔板振荡器 混合用
移液器 0.1-1000 µL范围
多通道移液器 96孔板操作
微量移液器 准确加样

操作步骤

第1天：细胞铺板

步骤1：细胞准备

  1. 检查细胞状态

    • 从工作细胞库复苏细胞或从传代培养中获取细胞
    • 确保细胞处于对数生长期
    • 细胞活力应>90%
    • 融合度：80-90%

  2. 收获细胞

    • 吸去培养基
    • 用PBS洗涤细胞
    • 加入适量胰酶-EDTA溶液
    • 37°C孵育12-15分钟
    • 显微镜下观察细胞脱落

  3. 终止消化

    • 加入含血清的完全培养基
    • 轻柔吹打使细胞分散

  4. 细胞计数

    • 取适量细胞悬液
    • 用血球计数板计数/自动细胞计数仪器

步骤2：调整细胞密度

  1. 用测试培养基调整细胞密度至 1 × 10⁵ cells/mL
  2. 确保细胞悬液均匀，无细胞团块
  3. 保持细胞悬液在室温下，避免沉降

步骤3：铺板

板类型 孔内容 体积 细胞数
荧光素酶检测板 100 µL细胞悬液 100 µL 1×10⁴ cells/孔
细胞毒性检测板 100 µL细胞悬液 100 µL 1×10⁴ cells/孔

要点：

  • 每个受试物需要1块板（荧光素酶检测，3重复）
  • 另设置平行板用于细胞毒性检测
  • 阳性对照和溶剂对照在同一板上
  • 边缘孔可加PBS或培养基以减少蒸发效应

铺板技巧：

  • 边加边轻轻摇动板，确保细胞均匀分布
  • 避免产生气泡
  • 避免细胞在加样过程中沉降
  • 如有沉降风险，可使用多通道移液器并快速操作

步骤4：培养

  • 将96孔板置于37°C，5% CO₂培养箱
  • 培养24小时
  • 直至细胞贴壁并进入对数生长期
  • 避免细胞生长至完全汇合

第2天：受试物处理

步骤5：制备受试物稀释系列

储备液制备（当天制备）：

  1. 根据所需浓度计算受试物用量
  2. 称量或移液适量受试物
  3. 溶解于DMSO至200 mM
  4. 对于无分子量物质：制备40 mg/mL溶液

系列稀释：

  1. 从200 mM储备液开始
  2. 使用2倍系列稀释制备12个浓度
  3. 所有稀释在DMSO中进行
  4. 最终浓度范围：0.098-200 mM

中间稀释：

  1. 取适量DMSO稀释液
  2. 在含血清培养基中25倍稀释
  3. 例如：10 µL DMSO溶液 + 240 µL培养基

最终工作液：

  1. 在测试板中再次4倍稀释
  2. 例如：50 µL中间稀释液 + 150 µL培养基
  3. 最终DMSO浓度：1%

步骤6：制备阳性对照

肉桂醛稀释系列：

储备液浓度 DMSO中主浓度（mM） 最终测试浓度（µM）
6.4 mM 6.4 64
3.2 32
1.6 16
0.8 8
0.4 4

制备步骤：

  1. 制备6.4 mM肉桂醛DMSO储备液
  2. 2倍系列稀释得到5个主浓度
  3. 按照与受试物相同的方法稀释

步骤7：制备溶剂对照

  1. 使用纯DMSO
  2. 按照与受试物相同的稀释步骤处理
  3. 最终浓度：1% DMSO
  4. 每个板设置至少6个重复孔

步骤8：处理细胞

更换培养基：

  1. 吸去旧培养基
  2. 每孔加入150 µL新鲜测试培养基（不含G418）

添加受试物：

  1. 每孔加入50 µL经25倍稀释的受试物或对照
  2. 最终孔体积：200 µL
  3. 最终DMSO浓度：1%
  4. 每个受试物浓度设置3个重复孔

加样顺序建议：

  • 从低浓度到高浓度
  • 避免交叉污染
  • 使用多通道移液器提高效率
  • 记录板布局

步骤9：孵育

  • 将处理后的板置于37°C，5% CO₂培养箱
  • 孵育48小时
  • 用铝箔或板盖覆盖以避免挥发
  • 避免板间交叉污染

第3天：荧光素酶活性检测

步骤10：细胞裂解

  1. 准备裂解缓冲液

    • 按制造商推荐配制
    • 室温平衡

  2. 吸去培养基

    • 小心地吸去培养上清
    • 避免扰动细胞单层

  3. 洗涤细胞

    • 每孔加入150 µL PBS
    • 轻柔洗涤
    • 吸去PBS

  4. 加入裂解液

    • 每孔加入适量裂解缓冲液（如30 µL）
    • 室温孵育至少20分钟
    • 确保完全裂解

步骤11：荧光素酶活性检测

发光检测仪设置：

参数 设置
注射体积 100/50 µL荧光素酶底物
等待时间 1秒
积分时间 2秒
检测模式 发光检测

检测步骤：

  1. 将板放入发光检测仪

  2. 按照预设程序自动运行

  3. 仪器自动：

    • 向每孔注入荧光素酶底物
    • 等待1秒
    • 测量发光强度2秒

  4. 保存数据用于后续分析

质量控制：

  • 确保发光检测仪背景稳定
  • 检查无孔间光交叉污染
  • 验证阳性和阴性对照响应

第4天：细胞毒性检测（可同时进行）

步骤12：MTT检测

制备MTT溶液：

  1. 称取MTT粉末
  2. 溶解于PBS至5mg/mL
  3. 过滤除菌（0.22 µm）
  4. 避光储存（现配现用最佳）

MTT孵育：

  1. 吸去培养基
  2. 每孔加入100 µL含 0.5mg/mL MTT的新鲜培养基
  3. 在37°C，5% CO₂条件下孵育3-4小时
  4. 避免光照

formazan溶解：

  1. 小心吸去MTT培养基
  2. 每孔加入100 µL 10% SDS裂解液或者异丙醇
  3. 孵育过夜（或至少4小时）
  4. 直至formazan完全溶解

步骤13：吸光度测定

  1. 在570 nm波长下测量吸光度
  2. 使用酶标仪或分光光度计
  3. 记录数据

数据分析

1. 参数计算

1.1 荧光素酶活性诱导倍数

计算公式：

\[诱导倍数 = \frac{L_{sample} - L_{blank}}{L_{solvent} - L_{blank}}\]

其中：

  • \(L_{sample}\)：受试物孔的发光读数
  • \(L_{blank}\)：空白孔（无细胞）的发光读数
  • \(L_{solvent}\)：溶剂对照孔的平均发光读数

1.2 EC₁.₅计算

线性插值公式：

\[EC_{1.5} = (C_b - C_a) \times \frac{1.5 - I_a}{I_b - I_a} + C_a\]

其中：

  • \(C_a\)：>1.5倍诱导的最低浓度（µM）
  • \(C_b\)：<1.5倍诱导的最高浓度（µM）
  • \(I_a\)：\(C_a\)浓度时的诱导倍数
  • \(I_b\)：\(C_b\)浓度时的诱导倍数

特殊情况：

  • 若在最低测试浓度（0.98 µM）已≥1.5倍诱导，则EC₁.₅设为<0.98

1.3 细胞活力计算

公式：

\[活力(\%) = \frac{V_{sample} - V_{blank}}{V_{solvent} - V_{blank}} \times 100\]

其中：

  • \(V_{sample}\)：受试物孔的吸光度读数
  • \(V_{blank}\)：空白孔的吸光度读数
  • \(V_{solvent}\)：溶剂对照孔的平均吸光度读数

1.4 IC₅₀和IC₃₀计算

线性插值公式：

\[IC_x = (C_b - C_a) \times \frac{(100 - x) - V_a}{V_b - V_a} + C_a\]

其中：

  • \(x\)：50或30（分别对应IC₅₀和IC₃₀）
  • \(C_a\)：>\(x\)%活力降低的最低浓度
  • \(C_b\)：<\(x\)%活力降低的最高浓度
  • \(V_a\)：\(C_a\)浓度时的活力百分比
  • \(V_b\)：\(C_b\)浓度时的活力百分比

2. 统计分析

2.1 显著性检验

对于每个显示诱导≥1.5倍的浓度：

  1. 使用双尾Student’s t检验
  2. 比较3个重复样品与溶剂对照
  3. 评估p值
  4. p <0.05视为统计学显著

2.2 重复性评估

重复要求：

  • 至少2个独立重复
  • 每个重复3个复孔（n=6）
  • 如2个重复结果不一致，进行第3个重复（n=9）
  • 每个独立重复在不同日期进行

数据一致性：

  • 比较不同重复的Imax值
  • 比较不同重复的EC₁.₅值
  • 评估剂量-反应曲线的一致性

3. 结果解释

3.1 判定流程图

敏感预测模型的流程图，该模型考虑了临界范围，并通过多次运行得出临界结果。下图KeratinoSens™预测应在既定方法或国际应用技术协会（IATA）的框架内进行考虑，更加详细的整合策略使用

OECD442D kensen

OECD 442D

3.2 阳性判定标准

在2/2重复或2/3重复中同时满足以下4个条件：

条件 标准
1. Imax ≥1.5倍且统计学显著（p<0.05）
2. 细胞活力 在EC₁.₅确定浓度时>70%
3. EC₁.₅ <1000 µM（或<200 µg/mL无分子量物质）
4. 剂量-反应关系 有明确的剂量依赖性增加

注意：

  • 4个条件必须同时满足
  • 在至少2个重复中满足
  • 剂量-反应应清晰可见

3.2 阴性判定标准

不满足阳性判定标准，且：

  • 测试浓度达到最大要求（2000 µM或2000 µg/mL）
  • 或达到细胞毒性（活力<70%）
  • 不属于不确定结果

3.3 不确定结果

以下情况视为不确定：

  1. 最大测试浓度<1000 µM（或2000 µg/mL）且未达细胞毒性
  2. 4个阳性条件中前3个满足但无明确剂量-反应关系
  3. 接近细胞毒性水平诱导（需要进一步测试）

进一步测试建议：

  • 调整浓度范围
  • 使用更窄的稀释因子（如1.33或√2）
  • 重新测试以确定诱导是否发生在细胞毒性之前

4. 质量控制标准

4.1 阳性对照接受标准

肉桂醛（64 µM）：

参数 接受标准
诱导倍数 2-8倍
EC₁.₅ 7-30 µM
统计显著性 p<0.05
细胞活力 ≥70%

可接受性：

  • 至少一个测试浓度（4-64 µM）诱导显著>1.5倍
  • 如果64 µM时诱导不在2-8倍范围，需检查剂量-反应

4.2 溶剂对照接受标准

参数 接受标准
变异系数（CV） <20%
平均发光强度 稳定

注意：

  • CV>20%的结果应丢弃
  • 需要重新进行实验

4.3 细胞毒性检测质量

  • 溶剂对照活力应接近100%
  • 阳性对照的IC₅₀应在预期范围内
  • 至少2个连续浓度细胞活力>70%

参考文献

  1. OECD (2012). Series on Testing and Assessment No. 168. The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins.

  2. Emter R, Ellis G, Natsch A (2010). Performance of a novel keratinocyte-based reporter cell line to screen skin sensitizers in vitro. Toxicol Appl Pharmacol 245:281-290.

  3. Natsch A, et al. (2011). The intra- and inter-laboratory reproducibility and predictivity of the KeratinoSens assay. Toxicol In Vitro 25:733-744.

  4. Natsch A, et al. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization. J Appl Toxicol 33:1337-1352.

  5. EURL-ECVAM (2014). Recommendation on the KeratinoSens assay for skin sensitisation testing.

  6. DB-ALM (2013) Protocol 155: KeratinoSens.

  7. OECD (2015). Guidance Document No 213. Performance Standards for assessment of proposed similar or modified in vitro skin sensitisation ARE-NrF2 luciferase test methods.