体外3T3 NRU光毒性测试标准操作程序 (SOP)

OECD 测试指南 432

本标准操作程序（SOP）描述了体外3T3中性红摄取（NRU）光毒性测试方法，用于识别经光激活的受试化学品的光毒性潜力。
Author

基于OECD TG 432 (2019)

Published

March 16, 2026

测试方法介绍

方法验证历史与背景

本测试方法是经正式验证的体外方法，用于评估化学品的光细胞毒性。

验证状态

该方法是欧盟替代方法验证中心（ECVAM）于1995-1998年间协调进行的国际验证研究的成果。验证过程遵循OECD系列测试与评估文件No. 34所述的原则。

方法发展历程

  • 1995年：该方法基于CVMP/EU/CVMP/032/95文件首次通过
  • 1996-1998年：进行全面的实验室间验证研究
  • 2000年：被欧盟批准为化妆品成分光毒性筛选的替代方法
  • 2004年：首次被OECD采纳为测试指南432
  • 2019年：最新版本更新，进一步明确了接受标准和决策标准

与其他验证方法的关系

方法 全称 主要应用
3T3 NRU PT 3T3细胞中性红摄取光毒性测试 细胞活力测试（本方法）
RSM 红细胞光溶血测试 红细胞膜光损伤评估
3T3 NRU PT + RSM 组合策略 提高预测准确性的整合方法

验证研究结论

  • 高预测能力：敏感性≥95%，特异性≥80%
  • 良好的重现性：实验室间变异系数低
  • 广泛的适用性：适用于多种化学类别
  • 动物福利优势：完全替代动物进行的光毒性测试

概述

目的

本标准操作程序（SOP）描述了体外3T3中性红摄取（NRU）光毒性测试方法，用于：

  • 识别经光激活的受试化学品的光毒性潜力
  • 评估化学品在光照和非光照条件下的细胞毒性差异
  • 预测化学品在体内的光毒性效应

原理

体外3T3 NRU光毒性测试基于比较化学品在有光照和无光照条件下的细胞毒性：

  • 细胞毒性通过中性红（NR）摄取量的浓度依赖性降低来评估
  • 中性红（NR）是一种弱阳离子染料，可通过非离子扩散穿透细胞膜并积聚在溶酶体中
  • 光毒性机制：光毒剂通过产生活性氧（ROS）等机制导致溶酶体膜通透性增加、pH梯度降低等不可逆变化
  • 测试时间：在处理和照射后18-24小时测量NR摄取量

适用范围

适用情况

适用于可能诱导光毒性效应的化学品，包括：

  • 局部给药的化妆品成分
  • 系统给药后分布到皮肤/眼睛的药物
  • 可能暴露于环境光的其他化学品

不适用情况

本测试不设计用于预测：

  • 光基因毒性、光过敏、光致癌性
  • 间接光毒性机制、代谢产物的效应、混合物的效应

初始考虑和限制

测试方法的主要局限性

UV/vis吸收预筛选要求

关键要求：只有当化学品在290-700 nm范围内具有显著UV/vis吸收时，才应进行光毒性测试。

吸收阈值：摩尔消光系数（MEC）> 1000 L mol⁻¹ cm⁻¹

意义：如果化学品无显著UV/vis吸收，其光激活的可能性极低，预筛选可以避免不必要的动物替代测试。

代谢产物不被测试

本体外测试系统不包含代谢激活系统，化学品的体内代谢产物可能具有光毒性。对于主要经代谢激活产生光毒性的化学品，结果可能为假阴性。

化学品混合物

本方法不适用于化学品混合物，混合物成分可能相互干扰（吸收、淬灭、协同或拮抗作用）。

UV吸收晶体的测试局限性

在测试浓度下形成UV吸收晶体的化学品，晶体沉淀可能导致假阳性或假阴性结果。

水不稳定性化学品

在水溶液中快速降解的化学品可能产生假阴性，测试期间（60分钟处理 + 50分钟照射）的稳定性是关键。

方法选择指导

整合测试策略（IATA）

根据OECD 2024年发布的《光毒性测试整合测试与评估策略指导文件》，建议采用以下分层策略：

第1层：物理化学数据收集
  → UV/vis吸收光谱（290-700 nm）
  → 如MEC < 1000 L mol⁻¹ cm⁻¹，无需进一步测试

第2层：体外光毒性测试
  → 3T3 NRU光毒性测试（本方法）
  → 评估PIF和MPE值

第3层：补充测试（如需要）
  → ROS（活性氧）生成试验
  → 3D皮肤模型测试
  → 其他确认性试验

测试流程决策树

flowchart TD
    A[开始：评估化学品] --> B[收集UV/vis吸收数据<br/>290-700 nm范围]
    B --> C{MEC > 1000 L mol⁻¹ cm⁻¹?}
    C -->|否| D[无需光毒性测试<br/>无光毒性潜力]
    C -->|是| E[进行体外3T3 NRU光毒性测试]
    E --> F{检查测试局限性}
    F --> G[考虑代谢激活需求]
    F --> H[检查溶解度和稳定性]
    F --> I[评估是否为混合物]
    G --> J[执行测试<br/>记录所有观察]
    H --> J
    I --> J
    J --> K[计算PIF和MPE]
    K --> L{PIF > 5 或 MPE > 0.15?}
    L -->|是| M[光毒性阳性]
    L -->|否| N{PIF < 2 或 MPE < 0.1?}
    N -->|是| O[光毒性阴性]
    N -->|否| P[结果不确定<br/>考虑补充测试]

测试方法摘要

测试系统

组件 描述
细胞系 BALB/c 3T3（克隆A31）小鼠成纤维细胞
检测终点 中性红（NR）摄取量
测试条件 有光照（+Irr）vs 无光照（-Irr）
照射剂量 5 J/cm² UVA（非细胞毒性剂量）
测试时间 3天（铺板→处理→检测）

参考物质

能力验证化学品

化学品名称 CAS号 预期PIF 预期MPE 光毒性
胺碘酮盐酸盐 19774-82-4 > 3.25 0.27-0.54 阳性
氯丙嗪盐酸盐 69-09-0 > 14.4 0.33-0.63 阳性
诺氟沙星 70458-96-7 > 71.6 0.34-0.90 阳性
蒽 120-12-7 > 18.5 0.19-0.81 阳性
原卟啉IX二钠 50865-01-5 > 45.3 0.54-0.74 阳性
L-组氨酸 70-00-4 < 1 0.05-0.10 阴性
六氯酚 70-30-4 1.0-1.7 0.00-0.05 阴性
十二烷基硫酸钠 151-21-3 1.0-1.9 0.00-0.05 阴性

推荐常规阳性对照

氯丙嗪（Chlorpromazine, CPZ）是推荐的常规阳性对照物质：

参数 可接受范围
CPZ (+Irr) IC₅₀ 0.1 - 2.0 μg/mL
CPZ (-Irr) IC₅₀ 7.0 - 90.0 μg/mL
PIF > 6

材料与试剂

细胞系

BALB/c 3T3细胞（克隆A31）

属性 规格
细胞类型 小鼠成纤维细胞
克隆 A31
物种 Mus musculus（小鼠）
组织来源 胚胎成纤维细胞

细胞系来源：必须从认可的细胞库获取

  • ATCC：目录号 CCL-163
  • ECACC：目录号 93061404

细胞质量控制

支原体检测
  • 细胞到达实验室时立即检测
  • 仅当检测结果为阴性时才使用
  • 之后每3-6个月定期检测
UV敏感性检查
  • 对工作细胞库（WCB）至少检查一次
  • 在最高使用代次进行测试
  • 5 J/cm²剂量下，阳性对照（CPZ）的PIF应 > 6
细胞代次管理
细胞库 代次范围 用途
主细胞库（MCB） < 20代 长期储存，原始来源
工作细胞库（WCB） < 40代 日常实验的细胞来源
实验使用 < 100代（优选< 60代） 测试用细胞

培养基与试剂

完全培养基

组分 浓度
DMEM 基础培养基
新生小牛血清 10% (v/v)
L-谷氨酰胺 4 mM
青霉素 100 IU/mL
链霉素 100 μg/mL

培养条件：37°C，5-7.5% CO₂，湿度≥95%

缓冲盐溶液

选择 EBSS（Earle平衡盐溶液）或 HBSS（Hanks平衡盐溶液）

要求：不含蛋白成分、不含光吸收成分（如酚红、维生素）、pH稳定

中性红溶液

工作液配制：50 μg/mL（由 0.5 mg/mL 母液 1:10 稀释）

  • 中性红（3-氨基-7-二甲基氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐）
  • CAS号：553-24-2
  • 溶解于无血清培养基

NR提取液（现配）

  • 49% 去离子水
  • 50% 乙醇
  • 1% 冰醋酸

受试化学品制备

溶剂选择（优先顺序）

  1. 缓冲盐溶液（EBSS/HBSS）
  2. DMSO - 最高1% (v/v)
  3. 乙醇 - 最高1% (v/v)

储存

  • 测试当天新鲜配制（除非稳定性数据支持）
  • 避免预先光激活或降解

仪器设备

细胞培养设备

设备 规格
CO₂培养箱 37°C，5-7.5% CO₂，湿度≥95%
生物安全柜 II级A2型
倒置显微镜 相差功能
96孔板 无菌、透明底

光照系统

光源（太阳模拟器）

推荐类型：

  1. 氙弧灯 - 与日光匹配最佳
  2. 掺杂金属卤化物弧灯 - 产热少、成本低

光谱要求：发射完整太阳光谱 290-700 nm，符合ISO D65标准

滤光器

滤光器类型 特点 应用
WG320 截止波长320 nm 标准配置
WG335 截止波长335 nm 进一步减少UVB
专用日光滤光器 符合ISO D65标准 最佳日光模拟

剂量测定

UVA计要求：宽带UVA检测器（315-400 nm），定期校准（每年1次）

日常校准步骤：

  1. 预热光源至少30分钟
  2. 将UVA计探测器放置在96孔板位置
  3. 覆盖实际使用的板盖类型
  4. 记录辐照度读数（mW/cm²）

照射时间计算：

\[ t = \frac{D \times 1000}{I \times 60} \]

其中：\(t\) 为照射时间（分钟），\(D\) 为剂量（J/cm²），\(I\) 为辐照度（mW/cm²）

示例：目标剂量5 J/cm²，测得辐照度1.7 mW/cm²

\[ t = \frac{5 \times 1000}{1.7 \times 60} \approx 49 \text{ 分钟} \]

分析设备

设备 规格
酶标仪 540±10 nm测量波长
微孔板振荡器 提取NR用
移液器 0.1-1000 μL范围

操作步骤

第1天：细胞铺板

制备细胞悬液

  1. 从工作细胞库复苏细胞或从传代培养中获取细胞
  2. 用完全培养基调整细胞密度至 1 × 10⁵ cells/mL
  3. 确保细胞处于对数生长期，活力>90%

铺板

板类型 孔内容 体积
测试化学品板（+Irr） 100 μL细胞悬液 1×10⁴ cells/孔
测试化学品板（-Irr） 100 μL细胞悬液 1×10⁴ cells/孔
阳性对照板（+Irr） 100 μL细胞悬液 1×10⁴ cells/孔
阳性对照板（-Irr） 100 μL细胞悬液 1×10⁴ cells/孔
周边孔（空白） 100 μL完全培养基 -

要点：每种受试化学品需要2块板（+Irr和-Irr）

培养

将96孔板置于37°C，5-7.5% CO₂培养箱，培养18-24小时，直至形成约50%汇合单分子层。

第2天：化学品处理与照射

制备受试化学品稀释系列

几何稀释系列（8个浓度）：

  1. 最高测试浓度：≤ 1000 μg/mL
  2. 使用恒定稀释因子（例如：√10或2）
  3. 保持最终溶剂浓度恒定（通常1% v/v）

处理细胞

  1. 吸去培养基
  2. 轻柔洗涤：每孔加入150 μL缓冲液，吸去
  3. 加入100 μL含相应浓度受试化学品的缓冲液
  4. 溶剂对照孔：加入含相同浓度溶剂的缓冲液
  5. 在暗处培养60分钟

光照/避光处理

光照板（+Irr）：在室温下通过板盖照射细胞，使用5 J/cm² UVA剂量（约50分钟）

避光板（-Irr）：在室温下保持在暗处，时间与照射板相同

洗涤与恢复

  1. 吸去测试溶液
  2. 用缓冲液洗涤2次（每孔150 μL）
  3. 加入100 μL新鲜完全培养基
  4. 置于培养箱过夜培养（18-24小时）

第3天：中性红摄取测定

显微镜检查

使用相差显微镜检查细胞形态、单分子层完整性、细胞生长状态

中性红摄取

  1. 预温育缓冲液至37°C
  2. 吸去培养基，用150 μL温育缓冲液洗涤细胞
  3. 加入100 μL中性红溶液（50 μg/mL，无血清培养基）
  4. 在37°C、5-7.5% CO₂条件下培养3小时

洗涤与提取

  1. 吸去中性红培养基
  2. 用150 μL缓冲液洗涤细胞
  3. 吸去缓冲液，彻底去除残留液体
  4. 加入精确150 μL NR提取液
  5. 在微孔板振荡器上温和振荡至少10分钟

吸光度测定

在540±10 nm波长下测量吸光度，使用空白孔作为参考。

数据分析

溶剂对照
检查项目 可接受标准
照射溶剂对照活力 ≥ 非照射溶剂对照的80%
溶剂对照OD₅₄₀ ≥ 0.4
溶剂对照PIF < 2
阳性对照（氯丙嗪，CPZ）
检查项目 可接受范围
CPZ IC₅₀(+Irr) 0.1 - 2.0 μg/mL
CPZ IC₅₀(-Irr) 7.0 - 90.0 μg/mL
CPZ PIF > 6

数据点要求

  • 至少8个浓度点
  • 覆盖完整的浓度-响应关系
  • 包括在50%活力上下的浓度点

细胞活力计算

\[ 相对活力(\%) = \frac{OD_{测试} - OD_{空白}}{OD_{溶剂对照} - OD_{空白}} \times 100 \]

光毒性指标计算

光刺激因子（PIF）

\[ PIF = \frac{IC_{50}(-Irr)}{IC_{50}(+Irr)} \]

  • IC₅₀(-Irr)：无光照条件下使活力降低50%的浓度
  • IC₅₀(+Irr)：有光照条件下使活力降低50%的浓度

特殊情况：如果一个化合物光照有细胞毒性，而无光照情况下无细胞毒性，可使用：

\[ PIF = \frac{C_{max}(-Irr)}{IC_{50}(+Irr)} \]

如果化合物在有光照和无光照都不表现为细胞毒性，则PIF = 1

平均光效应（MPE）

\[ MPE = \frac{\sum_{i=1}^{n} w_i \cdot PE_{c_i}}{\sum_{i=1}^{n} w_i} \]

其中：

  • $ PE_c = RE_c DE_c $（光效应）
  • $ RE_c = R_c(-Irr) - R_c(+Irr) $（响应效应）
  • $ DE_c = $（剂量效应）
  • $ w_i = {R_i(+Irr), R_i(-Irr)} $（权重因子）

软件工具

PhotoTox version 2.0：OECD秘书处提供PIF和MPE计算软件包

下载地址：https://www.oecd.org/en/topics/sub-issues/testing-of-chemicals/software-test-guidelines.html

软件安装与使用

仅支持Windows系统，运行 Setup.exe 安装。

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输入数据

选择 select source file 导入数据，只能接受96孔板布局的 txt 文件。

data input

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板子布局

在Layout中可编辑布局，手动输入检测样品的浓度（最少8个样品）。

拟合曲线

输入浓度和数据后，点击 curve fit 进行拟合。

curve fit

curve fit
Important

每次拟合后点击 Add to project，否则数据会被覆盖。

计算

将 +UV 和 -UV 数据拟合后添加到项目，打开 “Pair Evaluation” 计算 PIF 和 MPE。

pair test

pair test

结果解释

判读标准

PIF MPE 预测结果
< 2 < 0.1 无光毒性
≥ 2 且 < 5 ≥ 0.1 且 < 0.15 可疑光毒性
≥ 5 ≥ 0.15 光毒性

重要说明：PIF和MPE应同时考虑。如不一致，采取保守方法归类为”可疑光毒性”。

特殊情况处理

仅在最高浓度观察到光毒性

  • 检查实验充分性（是否达到最大可行浓度）
  • 评估暴露相关性（是否有皮肤吸收数据）
  • 考虑补充测试（ROS试验、3D皮肤模型等）

可疑/边界结果

  • 首先检查测试质量
  • 考虑重复测试或调整实验参数
  • 进行确认性测试

PIF无法计算

  • 使用MPE指标
  • 评估是否在最高浓度观察到显著差异（> 20%活力差异）

质量控制

细胞质量控制

  • 支原体检测：细胞到达实验室时检测，仅当阴性时使用
  • UV敏感性检查：对工作细胞库至少检查一次
  • 历史数据：建立阳性对照的MPE历史数据库

仪器质量控制

  • 光源：每次测试前检查辐照强度
  • 培养箱：每日记录温度和CO₂浓度
  • 酶标仪：定期校准波长和吸光度准确性

测试报告

测试报告应包括以下信息：

受试化学品

  • 识别数据、通用名、IUPAC名和CAS号
  • 物理性质和纯度
  • UV/vis吸收光谱
  • 稳定性和光稳定性

溶剂

  • 选择理由
  • 受试化学品在溶剂中的溶解度
  • 处理培养基中溶剂的百分比

细胞

  • 细胞类型和来源
  • 无支原体和其他污染
  • 细胞传代代次
  • 辐射敏感性

测试条件

  • 培养基类型和组成
  • 培养条件（CO₂浓度、温度、湿度）
  • 化学品处理持续时间
  • 照射参数（光源、滤光器、UVA剂量）
  • 中性红活力测试条件

结果

  • 各浓度下的细胞活力
  • 浓度-响应曲线
  • IC₅₀值和PIF/MPE
  • 测试接受标准

附录

附录A：测试流程图

flowchart TD
    A[第1天：细胞铺板] --> B[18-24 h培养<br/>形成50%汇合单层]
    B --> C[第2天：化学品处理]
    C --> D[60分钟暗培养]
    D --> E{分板}
    E --> F[+Irr板：5 J/cm² UVA照射]
    E --> G[-Irr板：暗处50分钟]
    F --> H[洗涤 + 新鲜培养基]
    G --> H
    H --> I[18-24 h恢复培养]
    I --> J[第3天：中性红摄取测定]
    J --> K[3小时NR培养]
    K --> L[提取 + 测定OD540]
    L --> M[数据分析：计算PIF/MPE]
    M --> N[结果判读]

附录B：决策树

flowchart TD
    A[评估化学品物理化学性质] --> B{UV/vis吸收光谱}
    B -->|MEC < 1000 L mol⁻¹ cm⁻¹| C[无需光毒性测试]
    B -->|MEC > 1000 L mol⁻¹ cm⁻¹| D[体外3T3 NRU光毒性测试]
    D --> E{PIF < 2 或 MPE < 0.1}
    E -->|是| F[无光毒性]
    E -->|否| G{PIF > 5 或 MPE > 0.15}
    G -->|是| H[光毒性]
    G -->|否| I[可疑光毒性<br/>需进一步评估]

附录C：PIF和MPE计算示例

示例：使用PIF判断

原始数据：

浓度（μg/mL） OD540 (+Irr) OD540 (-Irr)
0（溶剂对照） 1.20 1.18
0.1 1.15 1.16
0.3 0.95 1.12
1.0 0.60 1.05
3.0 0.25 0.85
10.0 0.10 0.55
30.0 0.05 0.30

计算步骤：

  1. 通过非线性回归确定IC₅₀：IC₅₀(+Irr) = 1.8 μg/mL，IC₅₀(-Irr) = 28.5 μg/mL
  2. 计算PIF：PIF = 28.5 / 1.8 = 15.8
  3. 判断：PIF > 5 → 光毒性阳性

附录D：验证研究数据摘要

实验室间验证研究（1996-1998）

参与实验室：11个欧洲实验室

测试化学品：20种

统计指标 结果
敏感性 100% (10/10)
特异性 80% (8/10)
准确率 90% (18/20)

附录E：阳性对照试剂准备

氯丙嗪储液制备（1 mg/mL，在DMSO中）：

  1. 精确称取10 mg氯丙嗪
  2. 加入10 mL DMSO
  3. 涡旋混合直至完全溶解
  4. 分装至小体积，避光保存于-20°C

工作液制备：在EBSS/HBSS中稀释至所需浓度范围，保持最终DMSO浓度恒定为1% (v/v)