毕赤酵母蛋白表达入门

毕赤酵母蛋白表达蛋白表达系统基础介绍，包括毕赤酵母分类，质粒种类等

Pichia pastoris/Komagataella phaffii Protein Expression

1. 毕赤酵母历史背景

毕赤酵母（Komagataella phaffii），曾被称为Pichia pastoris，是一种广泛应用于重组蛋白合成的表达系统，尤其在人类治疗性蛋白和食品工业中表现突出

  1. 1904年，德国微生物学家E. Hanssen首次建立“毕赤酵母属”（Pichia），奠定分类学基础
  2. 1919年，法国科学家Alexandre Guilliermond首次从法国栗树的分泌物中分离出一种酵母菌株，并将其命名为Zygosaccharomyces pastori（现保存为CBS704，NRRL Y-1603），这一菌株被认为是毕赤酵母的最早记录
  3. 随后，在20世纪50年代，美国微生物学家Herman Phaff从加利福尼亚州的黑橡树中分离出更多的菌株，并将其重新命名为Pichia pastoris
  4. 到20世纪70年代，Phillips石油公司（位于美国俄克拉荷马州巴特尔斯维尔）开发了一种利用毕赤酵母发酵生产高蛋白动物饲料和单细胞蛋白的工艺。该公司通过亚硝基胍诱变技术开发了NRRL Y-11430菌株（现保存为CBS7435），并利用其高效的甲醇代谢能力进行大规模发酵生产
  5. 随着全球石油危机的爆发，甲醇价格大幅上涨，使得单细胞蛋白生产的经济性下降。Phillips石油公司于1993年决定将毕赤酵母表达系统开放给研究实验室使用。此后，学术界和生物技术公司开始将注意力转向利用毕赤酵母作为重组蛋白生产的宿主
  6. 20世纪90年代，研究人员开发了多种表达载体和遗传修饰技术，使得毕赤酵母成为重组蛋白生产的理想宿主。例如 Invitrogen公司（现为ThermoFisher Scientific）推出了著名的Pichia Expression Kit，其中包含两种表达菌株GS115和KM71和两种表达载体（pPIC9和pHIL-S1），用于将目标基因稳定插入AOX1基因位点
  7. 1995年，随着分子生物学技术的发展，科学家们通过对核糖体RNA的测序分析，发现Pichia pastoris与其他酵母属的差异较大，因此将其重新归类为一个新属——Komagataella
  8. 2005年，C. Kurtzman进一步将毕赤酵母分为两个物种：Komagataella pastoris（包含法国分离株，简称K. pastoris）和Komagataella phaffii（包含美国分离株，简称K. phaffii）
  9. 2009年，科学家们完成了GS115菌株的全基因组测序，随后在2011年和2016年分别完成了CBS7435和DSMZ 70382菌株的基因组测序。这些基因组数据为毕赤酵母的基因功能注释和代谢网络重建提供了坚实的基础

毕赤酵母的基因组大小为9.4 Mbp，包含四条相对较大的染色体(2.9 Mbp、2.4 Mbp、2.3 Mbp和1.8 Mbp)

1.1 毕赤酵母优势

  • 拥有目前最强，调控机理最严格的启动子之一醇氧化酶基因AOX1启动子，非常利于外源基因的表达调控
  • 具有翻译后的蛋白加工修饰功能例如磷酸化、糖基化等，是一种不可多得的集聚多种优势的真核表达系统
  • 既可以在细胞内表达，也可在细胞外表达
  • 培养基成本低廉，培养条件简单，生长繁殖速度迅速
  • 外源基因可以单拷贝或者多拷贝的形式在特定的位点整合进酵母染色体上，伴随着染色体的复制而复制，有较高的遗传稳定性，同酿酒酵母一样以稳定的表达菌株存在
  • 可以进行大规模发酵，适合高密度培养，非常适合重组真核蛋白的工业放大化生产制备