OECD测试指南第442C(DPRA)：直接肽反应性测定

OECD化学品测试指南-体外化学法皮肤致敏性测试—直接肽反应性测定(DPRA)判定皮肤致敏物与非致敏物
作者

OECD (经济合作与发展组织)

发布于

2025年6月25日

关键词

OECD, 测试指南, 毒理学, 体外测试, 皮肤致敏，442C，DPRA

1. 背景

1.1 适用范围和局限性

DPRA旨在通过定量测定受试化学物与含赖氨酸或半胱氨酸的模型合成肽的反应性，来解决皮肤致敏性AOP的分子起始事件，即蛋白质反应性, 使用半胱氨酸和赖氨酸肽耗竭百分比值将物质归类为四种反应性类别之一，以支持皮肤致敏物与非致敏物的区分。

与LLNA结果相比，DPRA区分致敏物（即UN GHS 1类）与非致敏物的准确性为80%（N=157），敏感性为80%（88/109），特异性为77%（37/48）

注记

DPRA更可能低估显示低至中等皮肤致敏效力（即UN GHS 1B子类别）的化学物质，而不是显示高皮肤致敏效力（即UN GHS 1A子类别）的化学物质。基于现有整体数据，DPRA已显示适用于覆盖多种有机官能团、反应机制、皮肤致敏效力（通过体内研究确定）和理化性质的受试化学物

本测试方法不适用于测试金属化合物，因为已知它们通过共价结合以外的机制与蛋白质反应。受试化学物应可溶于适当溶剂中，最终浓度为100 mM，DPRA被认为在技术上适用于测试多组分物质和已知组成的混合物

不与肽共价结合但促进其氧化（即半胱氨酸二聚化）的受试化学物可能导致肽耗竭的潜在高估，从而导致可能的假阳性预测和/或被分配到更高的反应性类别

1.2 测试原理

DPRA是一种体外化学方法，可定量测定受试化学物在22.5-30°C孵育24小时后半胱氨酸或赖氨酸含肽的剩余浓度。

合成肽含有苯丙氨酸以辅助检测

相对肽浓度通过高效液相色谱（HPLC）梯度洗脱和220 nm UV检测测量, 然后计算半胱氨酸和赖氨酸肽耗竭百分比值，并在预测模型中使用，该模型允许将受试化学物分配到四种反应性类别之一，用于支持致敏物与非致敏物的区分

Ac-RFAACAA-COOH骨架如何理解

  • N端封闭：序列起始于乙酰基(Acetyl group) 它连接在第一个氨基酸（精氨酸）的氮原子上，模拟了蛋白质内部的环境，消除了N端的正电荷
  • 序列中的 R-F-A-A-C-A-A 通过肽键 ( −CO−NH− ) 依次串联
  • 丙氨酸 (A) 骨架主要作用是作为“填充物”维持肽链的螺旋倾向性和疏水性，不参与化学反应
氨基酸 单字母 侧链结构 作用与位置
精氨酸 R \(-(CH_2)_3-NH-C(NH)NH_2\) (胍基) 位置 1。带强正电荷，增加水溶性，防止多肽聚集。
苯丙氨酸 F \(-CH_2-C_6H_5\) (苄基) 位置 2。含苯环，提供疏水核心，模拟蛋白质内部的疏水环境。
半胱氨酸 C \(-CH_2-SH\) (巯基) 位置 5 (核心)。这是反应靶点。巯基上的硫原子具有强亲核性，会攻击致敏剂。
提示

Ac-RFAACAA-COOH 的骨架是一个乙酰化封闭的七肽链，其核心在于第5位的半胱氨酸残基，它被包裹在由精氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸构成的模拟蛋白环境中，专门用于“诱捕”亲电性化学物质

Ac-RFAAKAA-COOH骨架也是同样的原理

  • 靶心：K (赖氨酸) —— 绝对主角
  • 化学结构：赖氨酸的侧链是一个长链，末端有一个 ε-氨基 ( −NH 2)
  • 这个氨基具有亲核性。当遇到某些特定的致敏化学物质（比如醛类、酮类或某些酰化剂）时，这个氮原子会发起攻击，与化学物质形成共价键，从而耗竭肽链
特征 Ac-RFAACAA (半胱氨酸肽) Ac-RFAAKAA (赖氨酸肽)
反应原子 硫 (S) 氮 (N)
化学性质 硫原子非常“软”，反应活性极高 氮原子相对“硬”，反应活性稍低
捕捉对象 捕捉大多数强致敏剂 (如丙烯酰类) 捕捉特定的致敏剂 (如醛类、某些卤代物)
地位 主力军 (绝大多数致敏剂都攻击它) 补漏者 (防止漏掉那些不攻击硫、只攻击氮的化学物质)

1.3 熟练度测试化合物

表 1: 表1：用于证明直接肽反应性测定技术熟练度的推荐熟练度物质
熟练度物质 CASRN 物理状态 体内预测¹ DPRA预测² 半胱氨酸肽耗竭%范围³ 赖氨酸肽耗竭%范围³
2,4-二硝基氯苯 97-00-7 固体 致敏物（极强） 阳性 90-100 15-45
噁唑酮 15646-46-5 固体 致敏物（极强） 阳性 60-80 10-55
甲醛 50-00-0 液体 致敏物（强） 阳性 30-60 ≤ 24
苄叉丙酮 122-57-6 固体 致敏物（中等） 阳性 80-100 ≤ 7
法尼醛 19317-11-4 液体 致敏物（弱） 阳性 15-55 ≤ 25
2,3-丁二酮 431-03-8 液体 致敏物（弱） 阳性 60-100 10-45
1-丁醇 71-36-3 液体 非致敏物 阴性 ≤ 7 ≤ 5.5
6-甲基香豆素 92-48-8 固体 非致敏物 阴性 ≤ 7 ≤ 5.5
乳酸 50-21-5 液体 非致敏物 阴性 ≤ 7 ≤ 5.5
4-甲氧基苯乙酮 100-06-1 固体 非致敏物 阴性 ≤ 7 ≤ 5.5

¹体内危害和（效力）预测基于LLNA数据,体内效力使用ECETOC提出的标准推导
²DPRA预测应在DA或IATA框架内考虑. ³范围基于6个独立实验室产生的至少10个耗竭值确定

2. 测试前准备

如果使用替代HPLC设置，应证明其与DB-ALM方案所述验证设置的等效性（例如通过 表 1 中的熟练度物质）

对于验证研究中使用的本测试方法所述HPLC设置，单次HPLC运行最多可容纳26个分析样品（包括受试化学物、阳性对照和基于测试中使用的单个溶剂数量的适当溶剂对照数，每个进行三重复），在同一运行中分析的所有重复样品应使用相同的半胱氨酸和赖氨酸肽储备溶液。建议在使用前证明各肽批次的适当溶解性

2.1 含半胱氨酸或赖氨酸肽的制备

  1. 半胱氨酸（Ac-RFAACAA-COOH）和赖氨酸（Ac-RFAAKAA-COOH）含合成肽的储备溶液（纯度高于85%，最好>90%）应在其与受试化学物孵育前新鲜配制

  2. 半胱氨酸肽的最终浓度应为pH 7.5磷酸缓冲液中的0.667 mM，而赖氨酸肽的最终浓度应为pH 10.2乙酸铵缓冲液中的0.667 mM

  3. 缓冲溶液的配置

    • pH7.5 磷酸盐缓冲液：取5.8706g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O，CAS:10039-32-4, MW:358.14)和0.5646g磷酸二氢钠(Na₂HPO₄·2H₂O，CAS:10028-24-7; MW:177.99)，加入200mL超纯水溶解，测定pH。若偏酸性，加入0.1mol/L磷酸氢二钠溶液调节；若偏碱性，加入0.1mol/L磷酸二氢钠进行调节

    • pH10.2 醋酸铵缓冲液：取1.542g乙酸铵，加水200mL溶解，用氨水pH值调节到10.2

  4. 多肽稀释液的配置

    • 稀释溶剂A：含20%乙腈的pH7.5磷酸盐缓冲液。2mL乙腈加8mL pH7.5磷酸盐缓冲液，混合均匀
    • 稀释溶剂B：含20%乙腈的pH10.2醋酸铵缓冲液。2mL乙腈加8mL pH10.2醋酸铵缓冲液，混合均匀

  5. 多肽贮备液

    • 半胱氨酸多肽贮备液：称取15mg半胱氨酸多肽，加入已经0.5mL乙腈超声1min，然后加入pH7.5磷酸盐缓冲液29.9mL配置成0.667mM的溶液

    • 赖氨酸多肽贮备液：称取15mg赖氨酸多肽，加入pH10.2醋酸铵缓冲液28.96mL配置成0.667mM的溶液

  6. 多肽标准液体配制

标准液体每管设定为1mL，为了后续稀释到0.5mM做准备,0.667—>0.5mM

表 2: 半胱氨酸和赖氨酸多肽标准液体配制
目标浓度 (mM) 母液体积 (µL) 加溶剂体积 (µL) 终体积 (µL)
0.667 1000.0 0.0 1000
0.3335 500.0 500.0 1000
0.1668 250.1 749.9 1000
0.0834 125.1 874.9 1000
0.0417 62.6 937.4 1000
0.02084 31.3 968.7 1000
  1. 阳性对照和样品(受试物)的配制

阳性和样品最好当天现配，浓度均为100mM(mmol/L),阳性对照为90%以上的肉桂醛；若样品为混合物，按照20mg/mL浓度配制

溶剂选择：乙腈，水，乙腈/水(1:1), 异丙醇，丙酮，丙酮/乙腈(1:1),以及其他不影响肽稳定的溶剂

提示

若仍然不溶解，可尝试溶解在300µL的DMSO中，并用2700µL乙腈稀释(10x)；或者溶解1500µL的DMSO中，并用1500µL的乙腈稀释(2x)

DMSO可能导致肽二聚化

3. 实验步骤

3.1 多肽结合实验

按照下面表格制备反应液，每个反应设置3个平行，受试物与多肽混合避光反应24+-2h，温度为25度+-2.5度，在反应结束后1h内进行HPLC测定，并在30h内完成检测，若检测前出现沉淀，则采用100-400g低速离心，使得沉淀聚集至瓶底，再进样

表 3: 半胱氨酸和赖氨酸多肽孵育体系
项目 半胱氨酸多肽（1:10样品） 赖氨酸多肽（1:50样品）
多肽名称 半胱氨酸肽 赖氨酸肽
多肽浓度 0.667 mM 0.667 mM
多肽体积 750 µL 750 µL
有机溶剂 200 µL 乙腈 —
受试化学物 50 µL 250 µL
总体积 1000 µL 1000 µL
对照体系 pH 7.5 磷酸盐缓冲液（补足体系） pH 10.2 乙酸铵缓冲液（补足体系）
最终用途 1:10 孵育体系 1:50 孵育体系

3.2 对照样品准备

  • 受试物(样品)对照：用pH7.5磷酸盐缓冲液或pH10.2乙酸铵溶液配制，不含多肽，主要是用来确定受试物中的峰与半胱氨酸多肽峰或赖氨酸多肽峰是否存在叠加

  • 空白对照：用乙腈替代样品，对照A使用空白对照，用于考察HPLC稳定性；对照B使用空白对照，在反应24h之后，用于测定反应过程中多肽的稳定性

  • 溶剂对照：用溶解样品的溶剂替代受试物，对照C使用溶剂对照，用于考察溶剂对多肽的影响

  • 阳性对照：用100mM 肉桂醛来替代受试物

3.3 流动色谱条件

  1. 流动相

    • 流动相A：1L纯水中加入1mL三氟乙酸(0.1%)
    • 流动相B：1L乙腈中加入850µL三氟乙酸(0.85%-0.1%)

  2. 色谱柱：C18(十八烷基硅烷键合硅色谱柱 100mm * 2.1mm * 3.5μm)

  3. 检测器及检测波长

    • 紫外检测器：检测波长220nm
    • PDA光电二极管：多波长检测

流动相梯度洗脱程序

表 4: HPLC梯度洗脱程序
阶段 时间 (min) 流速 (mL/min) 乙腈 (%) 水相 (%) 操作说明
平衡 0.0 0.35 10 90 初始平衡
进样/保持 0–1 0.35 10 90 样品进入系统
线性梯度 1–10 0.35 10 → 25 90 → 75 主分离区
快速洗脱 10–11 0.35 25 → 90 75 → 10 洗出强保留物
强冲洗 11–13 0.35 90 10 清除残留物
再平衡 13–20 0.35 10 90 恢复初始条件（7 min）

每个设备，每个柱子还有要求出峰的时间都不同，结果也是不同的，使用此反相HPLC色谱柱，整个系统应在运行前用50%相A（水中0.1%（v/v）三氟乙酸）和50%相B（乙腈中0.085%（v/v）三氟乙酸）在30°C下平衡至少2小时

使用光电二极管阵列检测器，也应记录258 nm处的吸光度

  1. 数据处理

    每个样品中半胱氨酸或赖氨酸肽的浓度通过测量适当峰的峰面积（曲线下面积，AUC）并使用从标准品导出的线性校准曲线计算肽浓度，在220 nm处光度测定

\[\text{肽耗竭百分比} = \left[1 - \frac{\text{样品(受试物)中的肽峰平均面积}}{\text{溶剂对照C中的平均肽峰面积}}\right] \times 100\]

  1. 接受标准
  • 标准校准曲线应具有r²>0.99
  • 阳性对照肉桂醛三个重复的平均肽耗竭百分比值应在半胱氨酸肽为60.8%至100%之间，在赖氨酸肽为40.2%至69.0%之间（对于其他阳性对照需要建立参考范围），且阳性对照重复的最大标准差（SD）应为半胱氨酸耗竭百分比<14.9%，赖氨酸耗竭百分比<11.6%
  • 参比对照A的平均肽浓度应为0.50±0.05 mM，乙腈中九个参比对照B和C的肽峰面积变异系数（CV）应<15.0%

受试化学物结果要被视为有效，应满足以下标准：

  • 受试化学物重复的最大标准差应为半胱氨酸耗竭百分比<14.9%，赖氨酸耗竭百分比<11.6%
  • 适当溶剂中三个参比对照C的平均肽浓度应为0.50±0.05 mM

4. 预测模型

计算每个受试化学物的平均半胱氨酸和赖氨酸耗竭百分比值。计算平均值时，负耗竭被视为”0”。使用表1所示的半胱氨酸1:10/赖氨酸1:50预测模型，应使用6.38%平均肽耗竭的阈值来支持IATA或DA框架内皮肤致敏物与非致敏物的区分。应用预测模型将受试化学物分配到反应性类别（即低、中、高反应性）可能有助于在IATA或DA框架内为效力评估提供信息。

当受试物和半胱氨酸多肽和赖氨酸多肽都不发声共洗脱时，采用1:10半胱氨酸和1:50赖氨酸多肽模型

表 5: DPRA预测模型
半胱氨酸和赖氨酸耗竭%平均值 反应性类别 DPRA预测
0% ≤ 平均耗竭% ≤ 6.38% 无或最小反应性 阴性
6.38% < 平均耗竭% ≤ 22.62% 低反应性 阳性
22.62% < 平均耗竭% ≤ 42.47% 中等反应性 阳性
42.47% < 平均耗竭% ≤ 100% 高反应性 阳性

使用6.38%平均肽耗竭的阈值来支持IATA或DA框架内皮肤致敏物与非致敏物的区分,无法区别细分类，只能判断是否过敏

当受试物仅与赖氨酸多肽发生共洗脱时，采用1:10半胱氨酸多肽模型

表 6: 1:10半胱氨酸
半胱氨酸(Cys)耗竭% 反应性类别 DPRA预测
0% ≤ Cys耗竭% ≤ 13.89% 无或最小反应性 阴性
13.89% < Cys耗竭% ≤ 23.09% 低反应性 阳性
23.09% < Cys耗竭% ≤ 98.24% 中等反应性 阳性
98.24% < Cys耗竭% ≤ 100% 高反应性 阳性

当受试物与赖氨酸和半胱氨酸多肽发生共洗脱时，结论无法判定

5. 注意事项

  • 多肽消耗值为负号的时候，以0计算
  • 采用双多肽消耗时，统计推导的边界范围为4.95%-8.32%
  • 采用1:10半胱氨酸多肽模型时，消耗百分比在10.56%～18.47%

校准标准品和参比对照

项目 样品
校准标准品和参比对照 STD1, STD2, STD3, STD4, STD5, STD6, 稀释缓冲液, 参比对照A重复1, 参比对照A重复2, 参比对照A重复3
共洗脱对照 受试化学物1的共洗脱对照1, 受试化学物2的共洗脱对照2
参比对照 参比对照B重复1, 参比对照B重复2, 参比对照B重复3
第一组重复 参比对照C重复1, 肉桂醛重复1, 样品1重复1, 样品2重复1
第二组重复 参比对照C重复2, 肉桂醛重复2, 样品1重复2, 样品2重复2
第三组重复 参比对照C重复3, 肉桂醛重复3, 样品1重复3, 样品2重复3
参比对照 参比对照B重复4, 参比对照B重复5, 参比对照B重复6

三组参比对照（即仅由溶解在适当溶剂中的肽组成的样品）应包括在分析序列中：

  • 参比对照A：用于验证HPLC系统的适用性，乙腈替代受试物作为对照A
  • 参比对照B：包括在分析序列的开头和结尾，以验证分析时间内参比对照的稳定性，乙腈加入之后反应24h表示稳定性
  • 参比对照C：包括在分析序列中，以验证用于溶解受试化学物的溶剂不影响肽耗竭百分比，溶解样品的溶液加入多肽中