Cre-Lox

简单、重组率高的Cre-Lox系统

Cre-Lox/Cre-Loxp systerm

利用Cre-Lox系统，可以在特定细胞、组织或生物体，在特定时间点敲除或表达某个基因。实现对特定基因的时空特异性操作

Cre-Lox系统介绍

Cre重组酶

1981年，Nat Sternberg等报道了一种克隆自大肠杆菌P1噬菌体的蛋白——由343个氨基酸编码，38kDa的 Cre（Cyclization Recombination Enzyme）重组酶，属于酪氨酸重组酶家族，它能特异识别loxP位点，并介导loxP位点间的序列删除或重组。

Tip

酪氨酸重组酶类在活性位点上有一个Tyr残基，其侧链攻击连接到DNA，使得DNA之间能够交叉重组。该酶能特异性识别并催化34bp的loxP位点间的DNA发生位点特异性重组，反应无需能量辅助因子且快速达到动态平衡

Lox位点

Cre重组酶识别的回文DNA位点，也叫loxP (locus of X-over P1) 位点，长 34bp，其特征结构为ATAACTTCGTATA -NNNTANNN-TATACGAAGTTAT,方向是5‘-3’。两边反向互补的13个碱基为Cre重组酶的识别序列，中间的8个碱基为重组发生位置，这也决定了loxP的方向。N表示可变碱基，不同的碱基选择可形成不同的 Lox位点。

下图是LoxP位点及其突变体位点，解决基因泄露的问题

LopX

LoxP位点
ATAACTTCGTATA - GCATACAT - TATACGAAGTTAT
 \______/       |||||       \______/
  左臂（13bp）   间隔区       右臂（13bp）
  • 13bp重复序列：是 Cre酶的识别位点，两个重复序列是完全相同的
  • 8bp中间间隔序列：不对称，决定了 loxP 的方向性；重组的结果（如删除 vs 翻转）取决于两个loxP的方向。

Cre

Cre重组酶

当基因组内存在loxP位点时，一旦有Cre重组酶，便会结合到loxP位点两端的反向重复序列区形成二聚体。此二聚体与其他loxP位点的二聚体结合，进而形成四聚体。随后，loxP位点之间的DNA被Cre重组酶切下，切口在DNA连接酶的作用下重新连接。

Important

loxP 位点的方向是由其 中间的 8 bp 非对称间隔区（spacer）序列 决定的

  1. 切除：当两个Lox位点在同一染色体上且方向相同时，将切除同向Lox位点之间的DNA序列（也叫Lox侧翼序列，Flox序列）。
  2. 反转：当两个Lox位点位于同一染色体上且方向相反时，两个Lox位点之间的序列发生序列反转，即颠倒。
  3. 易位：如果两个Lox位点位于不同的染色体上且方向相同，则易位事件将导致DNA片段的交换。

Cre-fix

Cre机制
  • A loxP位点的基本结构
  • B Cre-loxP介导的易位重组
  • C Cre介导两同向loxP位点间的切除重组

体内Cre-lox系统的基础应用

利用Cre-Lox系统在小鼠体内实现对基因的时空特异性打靶(表达或敲除)，原则上需要建立两种小鼠。

首先，建立特异性Cre小鼠，该小鼠中的Cre重组酶由特定启动子驱动，可在特定细胞或组织或全身表达Cre重组酶。Cre重组的特异性由驱动Cre的启动子或增强子控制。

其次，需要建立Flox小鼠，即在该小鼠靶基因序列侧翼带有Lox位点。将上述两种小鼠杂交繁育，子代中可以获得既带有Cre又带有Flox基因的小鼠，即条件性基因打靶（表达或敲除靶基因）小鼠。

“Flox小鼠”是指基因中特定位点被两个loxP序列夹住（flanked by loxP）的小鼠，即带有“floxed基因”的转基因小鼠。

条件性基因表达

条件性基因表达所需要的Flox小鼠，一般带有一个沉默的转基因，也就是说在靶基因与启动子之间有一个“终止盒”（lox-stop-lox）。这个“终止盒”通常由强polyA信号和/或剪接供体序列构成，能阻止转基因的转录。这些Flox小鼠与细胞类型特异性表达Cre的转基因小鼠交配后获得的子代小鼠中，在每个表达Cre重组酶的细胞中，终止盒被Cre切除，因此仅在这些细胞中表达所需的转基因。

Tip

同向切除原理

条件性基因表达小鼠原理示意图

条件性基因表达小鼠原理示意图

条件性基因敲除

条件性基因敲除所需要的Flox小鼠，一般在需要切除的DNA片段两侧带有同方向的两个Lox位点（lox-GENE-lox）。与细胞类型特异性Cre小鼠交配后，Cre 重组酶会识别Lox位点，导致靶基因被敲除。由于 Cre 基因的表达受上游启动子的调控，因此启动子的时空特异性就决定了基因重组的时空特异性。

下图展示了基因敲除的原理

条件基因敲除

条件性基因敲除小鼠

Cre-Lox系统迭代

更加准确的进行遗传功能研究，时间特异性的Cre-Lox,即

传统的Cre-Lox本身做不到时间特异性

  1. 在目标基因的上下游插入两个LoxP位点(flox基因)
  2. 用一个特定的启动子驱动Cre重组酶基因的表达
  3. 启动子只要一活跃，Cre就会持续表达–> 立刻切除或倒位两个LoxP之间的DNA片段
  • 如果启动子是全身且胚胎(CMV,CAG启动子)
  • 如果用组织特异性启动子(Albumin启动子在肝脏，GFAP启动子在星形胶质细胞)，只能做到空间特异性

CreER系统

他莫昔芬（Tam）诱导的Cre系统–CreERT2在体内对药物诱导的敏感性更高

CreERT 是一种融合蛋白，由人雌激素受体（ER）的突变配体结合域与 Cre 重组酶组成。它的活性可以由 4-羟基-他莫昔芬（OHT）诱导，但不受天然 ER 配体的影响。

  • 在没有他莫昔芬的情况下，CreER融合蛋白与热休克蛋白90（HSP90）相互作用并存在于细胞质中
  • 给予他莫昔芬药物处理会破坏HSP90与CreER的相互作用
  • ER与Tam的相互作用诱导Cre的核易位
  • 在细胞核中，CreER识别loxP位点（图5.4）并使组织X中的基因Y失活

CreER

CreER

上图简略表示CreER系统步骤

  1. 核中在PromoterX启动子催动下表达Cre/LEB ER蛋白，形成Cre/ER/HSP90复合体
  2. 加入Tamoxifen后，HSP90解离开，剩下Cre/ER/T复合体
  3. Cre复合体作用在Loxp上，进行基因编辑

Cre/Tet系统

四环素诱导系统(tetracycline)或其衍生物 doxycycline（多西环素）

四环素诱导系统，也叫强力霉素（Dox，四环素衍生物）诱导的Cre系统。该系统有两种模式：Tet-on和Tet-off，分别是Dox依赖性Cre的激活和Dox依赖性Cre的失活。

Note

  1. 顺式作用元件（cis-regulatory element，CRE），是与结构基因串联的一段非编码DNA序列，一般位于转录点上游，作用是调节邻近基因的转录。

  2. 反式作用因子（英语：Trans-acting factor），也称为反式因子，是指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与靶基因转录效率调控的蛋白质或RNA。

Cre/Tet-on系统

核心系统:

  • 反向四环素控制反式激活因子（reverse tetracycline-controlled transactivator，简称 rtTA）
  • 四环素响应元件（TRE），通常是19个核苷酸的四环素操纵子（tetO）序列的7个重复，调节Cre基因的表达。

在Tet-on系统中，表达普遍存在的或组织特异性的启动子驱动的rtTA。在没有Dox的情况下，失活的rtTA无法与负责调控Cre基因的TRE序列结合，则Cre不表达。在Dox给药之后，Dox结合并激活rtTA。激活的rtTA与TRE序列结合并诱导Cre表达

TerOn

TetOn

Cre/Tet-off系统

核心系统:

  • 四环素控制反式激活因子（tetracycline-controlled transactivator，简称 tTA）
  • 四环素响应元件（TRE），通常是19个核苷酸的四环素操纵子（tetO）序列的7个重复，调节Cre基因的表达。

在Tet-off系统中，在没有Dox的情况下，激活的tTA能够结合Cre前的TRE序列并诱导Cre表达。而在Dox给药后，与Dox相互作用的tTA被灭活。灭活的rTA不再与TRE结合，因此Cre表达受到抑制。

TerOn

TetOff